Biologia molekularna

Moncia

[link widoczny dla zalogowanych]

magdaZ5

Dla leniwych:P
WYKŁADY:
Zgodnie z dogmatem centralnym biologii molekularnej info. genetyczna jest przekazywana w komórce tylko w 1 kierunku: od DNA do RNA.
Odwrotna transkrypcja -1970 Baltimore, Termin, Mizutani.
Wykrycie prionów – 1991, Prusiner
Kwasy nukleinowe (polimery zbudowane z nukleotydów): DNA koduje info. i RNA-kwas rybonukleinowy. Sekwencje zasad azotowych w kwasach nukleinowych zapisuje się w kierunku 5prim3prim
Nukleozyd=cukier+zasada azotowa-sluży do wydłużania nici DNA.
Nukleotyd=cukier+zasada azotowa+reszta fosforanowa
Nukleoid-obszar w komorce bakterii, w którym skoncentrowany jest materiał genetyczny (DNA) bakterii.
Nukleosom-podstawowa jednostka strukturalna chromatyny.Skład: 8 cząsteczek histonów, 1 cząsteczka H1, DNA o długości 165 do 245 par zasad.
Zasady azotowe-pochodne puryny(cytozyna, uracyl,tymina) i pirymidyny.
Synteza polinukleotydy następuje w wyniku polimerazy.
Konformacje przestrzenne DNA: B-DNA-powszechna forma w komórkach, A-DNA, Z-DNA-charakterystyczny zygzakowaty kształt.
Genom jądrowy-składa się z liniowych cząsteczek, które znajdują się w chromosomach. Liczba chromosomów nie ma związku z wielkością chromosomu.
Chromatyna to włóknista substancja, która występuje w jądrze.Zbudowana jest z : DNA, RNA, histonów, niehistonowych białek.Euchromatyna- rozluźniona forma chromatyny, zawiera głównie geny aktywne transkrypcyjne. Heterochromatyna to skondensowana forma chromatyny.
Podział kwasów rybonukleinowych: *RNA genetyczny, *RNA niegenetyczny: RNA kodujący- mRNA i niekodujący.
Typy dojrzewania RNA: 1 modyfikacja końców – wytwarzanie czapeczki przy 5 prim, poliadenylacja przy 3 prim, 2 składanie, 3 cięcie, 4 modyfikacje chemiczne (redagowanie RNA)
Rybosomy-organella służące do produkcji białek.
Markery molekularne, dzięki nim możemy:
-mierzyć zmienność genetyczną
-śledzić przemieszczanie się osobnika
-oceniać efekty inbredu
-identyfikować szczątki zwierząt i roślin
-badać nowe gatunki i śledzić historyczne drogi ich migracji
Znaczenie poznawcze oraz rozwiązywanie problemów ekologicznych o znaczeniu praktycznym:
-ocena stopnia zagrożenia gatunków na skutek występowania zjawiska inbredu
-ocena stopnia hybrydyzacji pomiędzy genetycznie zmodyfikowanymi roślinami uprawnymi a ich dziko żyjącymi krewnymi.
Markery molekularne jako źródło info.:
-generowanie zmienności w nieskończenie zmiennych cząsteczkach kwasu DNA
-niewyobrażalnie wysoki stopień zmienności genetycznej u większości gatunków
-metody molekularne pozwalające na identyfikacje info. zapisanych w DNA
Ekologia molekularna- dziedzina biologii, która zajmuje się badaniem wzajemnych oddziaływań pomiędzy organizmami, a także między nimi i środowiskiem ich życia.
Plastyczność fenotypowa-zjawisko polegające na możliwości genotypowego różnicowania się tych samych genotypów pod wpływem działania różnych warunków środowiska, np. gąsienica-wygląd różny w zależności od tego, w jakiej części drzewa żerują.
Przykład plastyczności: z jaj żółwia wylęgają się wyłącznie samice jeśli inkubacja odbywa się w niskiej temp., w średnich temp. – samce, a w wysokich samice.
Allozymy-różne formy białka odpowiadające różnym allelom.
Allozymy jako markery molekularne:
-próbki tkanki, całe osobniki (małe)
-ekstrakcja białek
-rozdzielanie białek (elektroforeza)  wnioskowanie o zróżnicowaniu genetycznym badanych osobników.
Ograniczenia:
-różnice w sekwencji DNA nie zawsze znajdują swoje odzwierciedlenie w zróżnicowaniu się białek
-próbki tkanki, całe osobniki (małe) – zabicie osobnika
-pozyskane próbki powinny być przechowywane w temp. -70 stopni.
-pełna info. zawarta jest w genomie każdego organizmu, analiza allozymow pozwala zaś dotrzeć jedynie do części tej info.
Markery genetyczne-dowolne cechy jakościowe organizmu, które podlegają dziedziczeniu wg praw Mendla, tzn. są warunkowane przez 1 gen i które można identyfikować prostymi matodami laboratoryjnymi i analitycznymi.
KLASA1: antygeny erytrocytarne, białka surowicy krwi i leukocytów, białka mleka i jaj, główny kompleks zgodności tkankowej MHC, sekwencje kodujące (geny)  polimorfizm wykrywany jest poprzez analizę produktów genów lub badania DNA tych genów (metody RFLP, SSCP, HD, sekwencjonowanie)
KLASA2: niekodujące sekwencje DNA (elektroforeza DNA), tandemowo powtarzające się sekwencje: mikrosatelitarne i minisatelitarne.
KLASA3: grupa markerów związana z polimorfizmem chromosomowym.
Cechy dobrego markeu genetycznego:
-silny polimorfizm
-dziedziczenie kodominujące
-wysoka frekwencja i równomierne rozłożenie w genomie
-powtarzalność
-prosta i szybka metoda wykrywalności
-neutralność selekcyjna (brak sprzężenia lub związku plejotropowego z genami obniżającymi płodność i przystosowanie do środowiska)
Budowa fizyczna genomu człowieka:
-genom jądrowy (nrDNA) BP 3 200 000 000 par zasad DNA, KB 3 200 000 pz, mb 3 200 milionów pz
-genom mitochondrialny (mtDNA)
Genom człowieka:
1) geny i sekwencje związane z genami: *DNA kodujący (jednokopiowy) *DNA niekodujący: pseudogeny, fragmenty genów, introny
2) DNA pozagenowy: * pojedyncze o małej liczbie kopii * powtarzający się DNA: A) powtórzenia rozproszone w genomie: elementy LTR, sekwencje SINE i LINE, transpozony DNA. B) DNA powtarzalny tandemowo: DNA minisatelitarny (powtarzający się motyw od 10 do 100 pz, zgrupowania długości do 20000 pz), DNA mikrosatelitarny (od 2 do 6 pz)
Pseudogeny- geny, które utraciły swoją funkcjonalność.
Fragmenty genów – krótkie regiony pochodzące z genu
Introny – niekodujące sekwencje nukleotydów, które są przepisywane na RNA w procesie transkrypcji, a następnie wycinane z RNA podczas składania genów. W niektórych intronach znajdują się wzmacniacze lub wyciszacze.
Zmienność sekwencji zarówno kodującego, jak i niekodującego DNA powoduje, że z wyjątkiem klonów, nie ma dwoch osobników o identycznym genomie.
DNA ulega zmienności podczas replikacji dzięki procesom rekombinacji i mutacji.
Błędy w replikacji DNA mogą prowadzić do: tranzycji, transwersji, inercji, delecji
-błędne parowanie nici opóźnionej
-transfer poziomy
-„niemendlowskie” rozdzielenie materiału genetycznego
DNA – niewyczerpane źródło danych.
Genom jądrowy i organellowy:
-potomstwo organizmów rozmnażających się płciowo dziedziczy w przybliżeniu połowę DNA po każdym z rodziców
-dziedziczenie dwurodzicielskie – gatunki diploidalne  w jądrze danego osobnika znajduje się 1 allel pochodzący od matki, 2 od ojca
-dziedziczenie jednorodzicielskie – genomy organellowe mitochondriów (mtDNA) i chloroplastów (cpDNA)
mtDNA w badaniach – większa wytrzymałość na warunki środowiskowe w porównaniu z DNA jądrowym, np. z 1 cm trzonu włosa nie można uzyskać jądrowego DNA, ale można otrzymać ok. 600 000 kopii mtDNA
Funkcje mitochondriów:
-wytwarzanie energii w postaci ATP.
-apoptoza – kontrolowana śmierć komórek.
-miejsce zachodzenia procesów metabolicznych.
Większość białek mitochondrialnych kodowana jest przez genom jądrowy.
Każda komórka posiada setki lub tysiące kopii mtDNA, po 2-10 kopii w pojedynczej organelli.
Są syntetyzowane na rybosomach cytoplazmatycznych i transportowane przez błony do mitochondriów.
Pochodzenie genomów organellowych – teoria endosymbiozy:
-geny organellarne są bardziej podobne do odpowiednich genów bakterii, niż do eukariotycznych genów jądrowych.
-opiera się na obserwacji, ze procesy ekspresji genu zachodzące w organellach są pod wieloma względami podobne do odpowiednich procesów u bakterii.
-mitochondia i chloroplasty są reliktami wolnożyjącymi bakterii.
Wielkość genomu mitochondrialnego (mtDNA): zwierzęta 16-20 kz, drożdże ok. 80 kz, rośliny wyższe 200-2500 kz
Mitochondria dziedziczenie wyłącznie od matki
Liczba cząsteczek mtDNA: komórka jajowa 100 000, plemnik 100
DNA mtDNA wyjątki od reguł:
-nie wszystkie mitochondria u zwierząt dziedziczą się w linii matczynej
-przeciekanie ojcowskie – przekazywanie mitochondriów na potomstwo przez ojca, stwierdzono u myszy, ptaków, ludzi.
-podwójne dwurodzicielskie dziedziczenie – 3 rodziny małż. Samice dziedziczą mitochondria od matek, a samce od matki i ojca  heteroplazmia (występowanie wiecej niż 1 haplotytu u jednego osobnika)
Komórki somatyczne – kilkaset cząsteczek mtDNA (śr. Po 5 na 1 mitochondrium): *homoplazmia – wszystkie mtDNA są dokładnie takie same, *heteroplazmia – mieszanina cząsteczek mtDNA
Mechanizm heteroplazmii:
Podczas podziału komórki rozdział mitochondriów między komórki potomne ma charakter przypadkowy. Skutkiem takiej biernej segregacji może być znaczne zróżnicowanie komórek potomnych pod względem proporcji zmienionych mitochondriów między:
-różnymi tkankami 1 osoby
-między osobnikami z mutacją należącymi do tej samej rodziny.
Sekwencja DNA obecnego w mitochondriach ludzkich:
DNA jest dwuniciową, kolistą cząsteczką, złożoną zaledwie z 16 569 pz, której jest zapisana info. o 37 genach:
13 z ok. 80 białek biorących udział w procesie fosforylacji oksydacyjnej
-22 rodzajach tRNA biorących udział w syntezie tych 13 białek na rybosomach mitochondrialnych
-2 rodzajach cząsteczek rybosomowego RNA
Markery mtDNA w badaniach:
- łatwe do analizy – genom mitochondrialny ma niewielkie rozmiary, co w połaczeniu z konserwatywnym układem genow umożliwia opracowywanie uniwersalnych starterów, amplifikujących różne fragmenty mtDNA u wielu kręgowców i bezkręgowców
-brak rekombinacji potomstwo ma zazwyczaj dokładnie taki sam genom mitochondrialny jak matka. W efekcie mtDNA jest pojedynczym haplotytem, przekazywanym przez matkę na dzieci.
Cechy genomu mitochondrialnego:
-cząsteczka kolista u większości organizmów, u mikroorganizmów eukariotycznych są zawsze liniowe.
-nie zawierają intronów
-brak w niektórych genach kodonów „stop”
-transkrypcji podlegają obie nici kolistego DNA, a niektóre geny nawet nakładają się na siebie
-brak sekwencji rozdzielających geny.
Mitochondrialny DNA u ssaków ewoluuje kilkakrotnie szybciej niż DNA jądrowy mimo to, że mtDNA jest obecny w wielu kopiach w każdej komórce. Przyczyny: niesprawny aparat naprawiający uszkodzony mtDNA, nie jest on chroniony przez chromatynę, powstawanie wolnych rodników w czasie procesów utleniania (mogą powodować uszkodzenia DNA)
Genom chloroplastowy:
-genom chloroplastowy (ctDNA) – koliste, nie otoczone białkami
-pojedynczy chloroplast zawiera 200-300 identycznych kopii ctDNA
-ctDNA koduje niektóre białka chloroplastowe, RNA chloroplastowy
-wielkość genomu ctDNA : 120-200 tys. pz
-zawiera geny dla ok. 100 białek
-bierze udział w dziedziczeniu pozajądrowym
Genetyczny ratunek:
-osobniki przenoszone z jednej populacji do innej często są źródłem nowych alleli – takie zjawisko może prowadzić do redukcji poziomu depresji inbredowej – genetyczny ratunek.
-zjawisko to tłumaczy się heterozją – zwiększonym poziomem dostosowania potomstwa, pochodzącego po rodzicach różniących się pod względem genetycznym – efekt maskowania szkodliwych alleli.
Identyfikacja płci u ptaków:
-gen CHD1 zlokalizowany w chromosomach płci
-gen CHD1-W znajduje się w chromosomie W i jest charakterystyczny dla samic
-gen CHD1-Z znajduje się w chromosomie Z i jest charakterystyczny zarówno dla samic jak i samców.
Test przypisania – polega na tym, że każdy osobnik zostaje przyporządkowany do populacji, do której jest najbardziej podobny pod względem genetycznym.
Region „kontrolny” nazywany również pętlą D:
-duża zmienność sekwencji – regiony hiperzmienne
-indywidualizacja śladów biologicznych
-ustalanie pokrewieństwa.
Genetyczne kody identyfikacyjne:
- strategie ochrony gatunku z reguły zakładają, że gatunek jest prawidłowo sklasyfikowany, ale żadna z niemal 20 koncepcji gatunku nie jest powszechnie akceptowana
- jednym z najnowszych sposobów identyfikacji gatunków jest DNA- kod identyfikacyjny oparty na sekwencji DNA
- identyfikacja uprzednio scharakteryzowanych gatunków przez porównanie udokumentowanych sekwencji oraz odkrywanie nowych gatunków na podstawie nowych sekwencji DNA
- genetyczny kod składa się z 1 lub kilku sekwencji
Zastosowanie tzw. zegara molekularnego możliwe jest uzyskanie info. o czasie jaki upłynął od rozdzielenia się sekwencji.
Orzecznictwo sądowe w sprawach związanych z ochroną przyrody:
- nielegalne zabijanie zwierząt-problem globalny
- łapy, pęcherze żółciowe i żółć niedźwiedzi są wykorzystywane w naturalnej medycynie chińskiej
- słonie-kość słoniowa
- polowanie na jelenie poza sezonem- „pasjonujący sport”
…ale teraz są markery
2001-jeleń zastrzelony nielegalnie dla poroża – znaleziono szczątki zwierzęcia z obciętym łbem – poroże znaleziono w domu jednego z kłusowników – analiza DNA – skazanie kłusowników.
Kłusownicy a zagrożone gatunki – np. słoń afrykański – zmniejszenie liczebności pomiędzy 1979 a 1987 z 1,3 mln osobników do 600 tys. Z powodu wysokiej ceny kości słoniowej.(zakaz handlu kością od 1989, ustalenie pochodzenia na podstawie markerów genetycznych)
Nielegalny handel – wyroby z zagrożonych gatunków – kawior jesiotrów, skł. Chińskiej medycyny naturalnej, rogi nosorożców, ozdobne zwierzęta do hodowli amatorskich, twarde drewno z lasów deszczowych
1975- konwencja o międzynarodowym handlu gatunkami dzikiej fauny i flory CITES- ograniczenie negatywnych efektów nielegalnego handlu zagrożonymi gatunkami.
3 kategorie gatunków zagrożonych wyginięciem:
1-zagrożone, 2-mogą wyginąć, 3-handel dopuszczalny w pewnym zakresie ale konieczna jest współpraca innych państw
Nielegalnie transportowane gatunki są często nie do rozpoznania po przetworzeniu na wyroby przeznaczone do sprzedaży, trudno udowodnić zarzut nielegalnego handlu à markery molekularne
Tradycyjna medycyna chińska:
Egzotyczna żywność-proceder zagraża żółwiom morskim-ich mięso osiąga na „czarnym rynku” wysokie ceny,
Dziczyzna-kraje afrykańskie, nielegalne polowania np. na goryle, węże, szympansy, antylopy, słonie, krokodyle

ĆWICZENIA:
Zasady pipetowania:
-nie wolno pobierać cieczy bez założenia końcówki
-nie należy zanurzać końcówki więcej niż 5 mm poniżej powierzchni cieczy
-nie należy dopuszczać do ześlizgiwania się kciuka z przycisku pobierania cieczy
-nie wolno odwracać pipety, jeśli końcówka jest wilgotna lub wypełniona cieczą
-ruch przycisku w czasie napełniania i wydawania cieczy powinien być płynny i powolny
-po zakończeniu pracy, pipetę należy umieścić w statywie.
Etapy pracy z DNA: prawidłowe pobieranie materiału biologicznego, prawidłowe oznaczanie próbki, transport, przechowywanie, izolacja DNA, charakterystyka i przechowywanie DNA
W zależności od rodzaju kolekcjonowanych tkanek do ekstrakcji DNA wykorzystuje się:
-próbówki próżniowe z antykoagulantem (krew)
-jałową watę (wymazówka)
-bibułę nasączoną konserwantem (karty FTA), krew, komórki nabłonka (mocz, ślina) i sperma.
-pojemnik z roztworem soli (kał)
-szczele woreczki foliowe (tkanki miękkie i twarde)
-papierowe koperty (wlosy, pióra)
Najlepszy materiał wyjściowy do ekstrakcji DNA u zwierząt- krew obwodowa.
*pobieranie i przechowywanie – probowki próżniowe z antykoagulantem (EDTA)
*inne antykoagulanty – można stosować pod warunkiem, że nie będą interferowały w następnych etapach pracy z DNA.
Należy pamiętać, iż krew pobrana do badań cytogenetycznych powinna być pobierana do strzykawek zawierających heparynę, która inhibuje niektóre enzymy restrykcyjne.
Materiały najczęściej wykorzystywane do izolacji DNA:
*w przypadku zwierząt:
-tkanki miękkie – skóra, serce, wątroba, nerki
-tkanki twarde – szpik, chrząstki, substancja gąbczasta kości
-materiał biologiczny pozyskany przyżyciowo w sposób nieinwazyjny – włosy z cebulkami, pióra ptaków, wylinki, fragmenty skrzydeł motyli i łuski ryb.
W badaniach zwierząt można również używać materiału biologicznego wykorzystywanego w genetyce człowieka:
-w diagnostyce prenatalnej – komórki kosmówki pobierane w 10-11 tygodniu ciąży
-z hodowli komórek płynu owodniowego- analiza wykonywana w 15 tygodniu ciąży
-w kryminalistyce – plamy krwi, nasienia.
*w przypadku materiałów muzealnych i skamielin do badań starożytnego DNA wykorzystuje się czaszkę, kości, zęby.
*w przypadku roślin- liście i młode siewki
Ekstrakcja DNA z komórki zwierząt  tzw. Całkowity DNA: * kwas nukleinowy z jądra komórki * kwas nukleinowy z cytoplazmy, mitochondrialny DNA (mtDNA)
Cel izolacji: uzyskanie z maksymalną wydajnością wysokocząsteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymow, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA.
Metody izolacji DNA:
-z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczania preparatów
-przebiegająca poprzez wysolenie białek z lizatów komórek
-poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA
W większości laboratoriów DNA jest izolowany techniką manualną.
Najbardziej popularne techniki rozdziałów makrocząsteczek – techniki elektroforetyczne – pozwalają osiągnąć bardzo wysoki poziom rozdzielności.
Wykorzystuje się ją do: rozdziału elektroforetycznego ujawniania form różniących się ruchliwością, która zależy od:
-wielkości i ładunku
-konformacji przestrzennej
-parametrów fizycznych rozdziału (napięcie, temp., stężenie nośnika – żelu)
Szybkość elektromotorycznej migracji DNA w żelu zależy od:
-masy cząsteczkowej DNA – cząsteczki liniowe migrują w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log10 z ich masy
-konformacji DNA – cząsteczki o takiej samej masie i w takim samym zelu wędrują z różną prędkością: forma CCC – koliste zwinięte, forma C – liniowa, forma C – kolista.
-stężenia agarowy
-natężenia pola elektrycznego – przy niskim natężeniu pola migracja liniowego DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia.
-składu buforu do elektroforezy – ruchliwość elektroforetyczna jest zależna od składu i siły jonowej buforu – DNA migruje wolno, przy zbyt wysokiej – wydziela się duża ilość ciepła, co może doprowadzić do upłynnienia agarowy i denaturacji DNA.
ŻEL
Akryloamid pozwala przygotować nośniki o bardzo gęstym usieciowieniu i niewielkich porach, co umożliwia separację polinukleotydów o wielkości 5-2000 pz.
Nośniki agarozowe charakteryzują się znacznie uboższym usieciowieniem i większymi porami. Pozwala to na separację znacznie większych fragmentów kwasow nukleinowych 50 30 000pz.
Bufory stosowane do:
-bufor Tris-fosforanowy-TPE
-bufor alkaliczny
-bufor Tris-boranowy-TBE
-bufor Tris-octanowy-TAE
Ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego można wyróżnić:
-elektrofotorezę kapilarną – określona często skrótem HPCE
-elektroforeza pionowa
-elektroforeza pozioma
Ponieważ kwasy nukleinowe nie mają właściwości amfoterycznych, ich separacja jest znacznie prostsza. Kwasy nukleinowe obdarzone są trwałym ładunkiem ujemnym, w warunkach elektrolitów stosowanych do elektroforezy, ze względu na obecność grup fosforanowych.
Nośnik elektroforetyczny przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek.
Zalecanym sposobem jest obciążenie i zabarwienie próbki dobrze rozpuszczalną substancją.
Markery wielkości – do określenia wielkości analizowanych fragmentów należy zastosować wzorce o znanej wielkości masy cząsteczkowej.
Barwienie żeli – bromek etydyny – silny mutagen.
Ocena elektroforetyczna DNA – jakościowa:
-żel do elektroforezy
-odważyć 1g agarowy
-dodać 100 ml buforu TBE 1*stęż.
Czystość DNA – obliczana jest ze stosunku absorbancji 260/280
Wartość 1,5 – w badanym preparacie DNA jest 50% białka
Poniżej 1,6 – preparat zanieczyszczony białkami.
Reakcja łańcuchowa polimerazy PCR:
-należy do najważniejszych metod biologii molekularnej
-jest podstawową techniką badawczą i diagnostyczną wykorzystującą zdolność DNA do replikacji
-metoda opracowana w 1987 w USA
-jest enzymatyczną metodą amplifikacji (powielania) określonych sekwencji DNA
-jest katalizowana, podobnie jak to się dzieje w komórkach, przez polimerazy DNA, zwane także replikazami.
-pozwala na namnożenie określonych odcinków DNA w dowolnych potrzebnych ilościach
-umożliwia ona analizę DNA nawet w przypadku bardzo małej jego ilości – możnaamplifikować poszukiwane odcinki DNA, dysponując DNA wyizolowanym nawet z pojedynczych komórek.
Reakcja PCR obecnie odbywa się za pomocą termocyklera.
PCR:
-umożliwia specyficzną amplifikację In vitro wybranych odcinków DNA i RNA przepisanych na CDNA, dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych do sekwencji docelowej
-niezbędna jest znajomość sekwencji nukleotydowych
-czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad milion razy mimo obecności innych sekwencji
Skład mieszaniny reakcyjnej – PCR:
-jednoniciowe DNA lub CDNA
-dwa startery
-dNTP i trifosforany
-termostabilna polimeraza
-kationy Mg2+
-bufor reakcyjny
Kolejność dodawania składników: połączyć bufor z wodą dejonizowaną, dodać dNTP,
startery, polimerazę i badaną probę. W przypadku, gdy analizujemy kilka lub wiecej prób pierwszym etapem jest sporządzenie PREMIKSU.
Metoda PCR stanowi odwzorowanie procesu replikacji DNA – dochodzi do syntezy nici DNA.
Polimeraza DNA zaczyna syntezę od startera.
Powtarzanie przez denaturację i denaturację – uzyskanie DNA w dużej ilości.
Reakcja amplifikacji DNA:
-denaturacja dwuniciowego DNA w temp. 92-96 stopni
-przylączenie starterów w temp. 37-72 stopnie
-wydłużanie starterów polegające na dołączeniu, począwszy od wolnego końca 3 prim – OH startera, nukleotydów komplementarnych względem amplifikowanej nici DNA, proces zachodzi w temp. 72 stopni.
Metody oparte o PCR są: szybkie, oszczędne, akceptowane, powtarzalne, swoiste.
Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR są: stężenie jonów Mg, dNTP, aktywność polimerazy Taq, zmiana profilu temperaturowego cyklu.
Metoda PCR multipleks:
-pozwala na równoczesną amplifikację kilki regionów genomu w jednej probówce przy zastosowaniu rożnych par primerów.
-znalazła szerokie zastosowanie, np. do wykrywania czynników zakaźnych, wykrywania różnego rodzaju mutacji
-równoczesna amplifikacja więcej niż 1 regionu DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej obniża koszty eksperymentów, oszczędza pracę i czas, a także zmniejsza ryzyko kontaminacji.
Metoda wewnętrzna PCR:
-polega na amplifikacji mniejszego odcinka DNA, zawartego w obrębie wcześniej amplifikowanego dłuższego fragmentu
-produkt tej reakcji może być stosowany jako: sonda molekularna w hybrydyzacji, kontrola specyficzności amplifikacji matrycy.
Metoda losowej amplifikacji polimorficznego DNA (RAPD):
-technika RAPD umożliwia równoczesną detekcję polimorfizmu wielu loci w całym genomie
-wymaga zastosowania dowolnego startera o długości od kilku do kilkunastu nukleotydów
-są stosowane w pierwszych badań genomu danego gatunku, zwłaszcza gdy jego zmienność genetyczna nie jest jeszcze poznana.
RAPD stosowane w badaniu zróżnicowania DNA jądrowego między osobnikami i populacjami danego gatunku. Jest to metoda losowej amplifikacji fragmentów DNA, a której stosowany jest jeden starter. Niższa jest temp. przyłączania starterów do matrycowego DNA, a liczba cykli reakcji jest większa (40-50)
Badanie ekspresji genów:
-zapis info. genetycznej oraz jej ujawnienie się w postaci cechy (ekspresja genu) związane są z funkcjonowaniem kwasów nukleinowych.
-info. RNA powstaje podczas transkrypcji genów ulegających ekspresji w komorce i z tego względu jest to najbardziej zróżnicowana klasa kwasów rybonukleinowych.
Ekspresja genów – etapy:
-transkrypcja – synteza mRNA na matrycowej nini DNA
-wycinanie intronów nazywane składowaniem RNA
-translacja
Po zakończeniu obróbki potranskrypcyjnej mRNA przechodzi do cytoplazmy i tam łączy się z rybosomami.
Badanie ekspresji genu na poziomie transkrypcji:
-z wykorzystaniem modyfikacji PCR: RT-PCR, PCR w czasie rzeczywistym
-nie będące modyfikacjami PCR: macierze DNA (zwanych też chipami DNA)
RT-PCR odwrotna transkrypcja PCR: polega na tym, że łańcuchowa reakcja polimerazy jest poprzedzona odwrotną transkrypcją, podczas której na matrycy mRNA syntetyzowany jest komplementarny DNA (nazywany CDNA). Reakcja ta przebiega dzięki zastosowaniu enzymu odwrotnej transkryptazy.
PCR w czasie rzeczywistym: stosowana jest do pomiaru ilościowego kopii genu, transgenu czy genomów wirusowych i bakteryjnych lub poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach.
Ilość kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowana w każdym cyklu reakcji amplifikacji. Liczba cykli reakcji PCR po których poziom fluorescencji przekroczy zdefiniowany próg jest stosowana do obliczenia ilości badanych cząsteczek obecnych w mieszaninie na początku reakcji.
Do środowiska reakcji wprowadzamy znakowane nukleotydy, bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów określić ilość matrycy użytej do reakcji.
-dostarcza info. na temat ilości DNA w badanej próbie
-pozwala na monitorowanie przebiegu łańcuchowej reakcji polimerazy
-ocena ilości DNA w próbie może być przydatna w wielu badaniach ekologicznych – info. o relacji między ekspresją genu a ujawnieniem określonych cech fenotypowych.
Enzymy restrykcyjne PCR-RFLP:
-podstawowe narzędzia inżynierii genetycznej
-rozpoznają Ciśle określone sekwencje dwuniciowego DNA i przecinają cząsteczki DNA w obrębie tych sekwencji
-rozpoznawane sekwencje są np. cztero- lub sześcionukleotydowe, mają charakter palindromów
-po przecięciu powstają lepkie lub tępe końce
-grupa – endonukleazy
-izolowane z bakterii lub sinic
-przecinają obie nici DNA w miejscu występowania krótkich, kilkunukleotydowych sekwencji
-charakterystyczne dla komórek bakteryjnych
-model restrykcji – modyfikacji
Nazewnictwo: pierwsza litera pochodzi od nazwy rodzajowej bakterii lub sinic, druga i trzecia od dwóch pierwszych liter nazwy gatunkowej.
Podział restryktaz wg rodzaju wytwarzanych końców: tępe końce – nici rozcięte naprzeciwko siebie, końce kohezyjne (lepkie)
Izoschizomery:
-enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA
-w obrębie grupy nie zawsze cięcie w tym samym miejscu
Podział restryktaz wg sekwencji rozpoznawanej:
-czwórkowe, rozpoznają sekwencję DNA złożoną z 4 nukleotydów (statystycznie co 256 bp)
-szóstkowe, rozpoznają sekwencję DNA złożoną z 6 nukleotydów (co ok. 4096 bp w DNA)
-ósemkowe, stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.
Metoda chemicznego sekwencjonowania Maxama – Gilberta: polega na częściowej, chemicznej degradacji oczyszczonego fragmentu DNA.

eewelinaa

jak ktos chce to moge przeslac fotki z pytaniami jakie byly na zerowce

[link widoczny dla zalogowanych]

MOTOROWIEC

bardzo prosze!

eewelinaa

[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]

niektore da sie rozczytac ;p

BezstronnyObserwator

A może ktoś ma ten I zestaw rozwiązany?? hę?

andrzej

niech ktoś wrzuci odpowiedzi do zestawu I bo wiadomo że na egzaminie miały pewne osoby już rozwiazanie. Niech przynajmniej teraz wrzucą dla tych którzy będą pisali pierwszy termin.

Adrian

a pierwszy termin tez w formie testu?

andrzej

a wiadomo może też..

ala

magda sie pytala i tez ma byc test

madam_87

Właśnie poprosimy o wstawienie testu skoro ktoś już go miał na na I egzaminie (pomijając to że było to niezbyt koleżeńskie że nie wstawił wczesniej ) to niech chociaż teraz wstawi

stefka

Jak ktoś teraz nie zaliczy testu to wstawia 2 czy poprzednią ocenę?

andrzej

mówiła że 2 nie stawia ale czy teraz też nie bedzie... trzeba by z nią zagadac